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如何避免抗体遭受再难?抗体挑选攻略告知你。

如何避免抗体遭受再难?抗体挑选攻略告知你。

发布时间:2019-06-27

抗体问题一直困扰着广阔科研工作者,抗体市场鱼龙混杂,虽然是一个名字但是每一个对应的质量都是不同的。小编今天给大家分享一些抗体挑选的经历~检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供挑选,为缩小抗体的挑选规模选中适宜的抗体,需求考虑如下几种要素:

1. 剖析或运用的类型

一般抗体阐明书都列出该抗体经实验验证过适用于何种剖析类型,如:可以运用于 WB IHC ICC ELASA 剖析等,假如抗体阐明书没有提及的运用类型,并不意味着该抗体不适用于此种剖析运用类型,而仅是阐明没有经过此种剖析实验验证,假如抗体不适用某些剖析实验,则会在抗体阐明书上标明出来不适于某剖析实验。

2. 样本蛋白的结构性质

了解样本蛋白的结构性质有助于挑选最适宜的抗体,至少两方面要素需求考虑待测样本蛋白的结构域:抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来,其间的免疫原包含:全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体或细胞,抗体阐明书一般都有免疫原的描述,假如计划检测的是蛋白片断或一种特别的同型物或蛋白全长的某一区域,则有必要挑选用含此片段域的免疫原制备出的抗体。假如计划用 FACS 流式检测活细胞的外表蛋白,则需求挑选含该外表蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。

样本的提取或处理过程:某些抗体要求样本经过某些特别处理,例如:许多抗体只辨认复原和变性的、表位已暴露不受二级四级结构阻止的蛋白样本,另一方面,某些抗体仅辨认天然折叠状态的蛋白。当挑选免疫组化的抗体时,应留意某些抗体只辨认未固定的冷冻的安排,而另一些抗体则适用于无需抗原修正的甲醛固定石蜡包埋的安排,这些都会在抗体阐明书上运用部分标明出来。

3. 样本的物种 

应挑选物种相同或有交叉反响的抗体,抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反响,因其氨基酸序列同源性较高,假如样本的品种未列入抗体阐明书上的交叉反响种属表中,并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白,而只是表示该物种没有用此抗体检测验证过,应通过序列比对的办法来预测交叉反响,可运用 Expasy 和 NCBI BLAST 来进行不同物种蛋白同源性比对。

4. 抗体宿主的品种

一抗的挑选

一般说来,在运用偶联二抗结合无偶联物的一抗时,一抗宿主动物的物种挑选较为重要,对于免疫组化而言,尽可能挑选与样本不同种系物种的一抗,从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反响,例如:检测小鼠样本蛋白,则不应挑选小鼠或大鼠源的一抗,zui好选兔源的一抗,则二抗则可挑选偶联了检测分子的抗兔 IgG。

假如挑选有偶联物的一抗则不适用上述情况,除免疫组化外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测办法,则抗体宿主物种的影响不大,如对不含 IgG 的细胞裂解物样本的 western blotting 检测,尽管如此,含有血清的安排裂解物和安排培养上清中含有免疫球蛋白,复原变性样本中含IgG,在western blot 检测中则结合呈现 IgG 分子50 and 25 kDa 的重链和轻链条带。

二抗的挑选

二抗应选用与运用的一抗相同的物种来源,例如:假如你的一抗是小鼠的单克隆抗体,二抗则选抗小鼠的二抗 anti-mouse secondary 。建议检查二抗阐明书保证该抗体适用于你的检测运用, 二抗一般连接荧光素 FITC 或发光团。

两层染色抗体的挑选

两层染色抗体的挑选用未偶联一抗进行细胞培养物或安排切片的两层免疫染色要求一抗来源于不同物种而且二抗分别辨认其间之一,二抗阐明书应描述其与其它物种来源的免疫球蛋有否有交叉吸附。


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